M-MLV Reverse Transcriptase

Описание

Обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей (Moloney Murine Leukemia Virus) – M-MLV обратная транскриптаза, является РНК зависимой ДНК полимеразой, которая осуществляет синтез цепи ДНК на РНК матрице. M-MLV обратную транскриптазу используют для синтеза первой цепи кДНК. M-MLV обратная транскриптаза позволяет получать транскрипты до 5 000 п.н.

Хранение

-20°C. Активность фермента падает примерно в 4 раза за 10 дней при +25°C.

Транспортировка

+4°C.

Состав буфера

Буфер с Mg²⁺ (x5):
250 mM Тris -HCl, pH8.3 / 25°C, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 50 mM DTT

Применение

Синтез первой цепи кДНК, ОТ ПЦР, получение кДНК на матрицах РНК со сложной вторичной структурой. Проведение реакции обратной транскрипции при температурах 42°C-55°C.

Особенности

Данный фермент является мутированным и более термостабильным, чем вариант дикого типа, что позволяет проводить реакцию обратной транскрипции при температуре до 60°C. Это необходимо для получения ДНК-транскриптов на матрице РНК со сложной вторичной структурой. С помощью дополнительных мутаций у данного фермента удалена активность РНКазы-Н, что способствует увеличению длины получаемых транскриптов.

T4 ДНК лигаза

Описание

Т4 ДНК лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5'-фосфатом и 3'-ОН группой расположенных рядом оснований в ДНК. Т4 ДНК лигаза способна соединять как липкие, так и тупые концы ДНК. Фермент может также "восстанавливать" ники (nicks) в двухцепочечной ДНК, РНК или ДНК/РНК гибридах.
1 ед. Вейсса - это количество фермента, которое катализирует обмен 1 нмоля ³²P из пирофосфата в [γ,β-³²P]АТФ в течении 20 мин при 37°C. 0.015 ед. Вейсса Т4 ДНК лигазы лигируют 50% фрагментов бактериофага λ расщепленных по HindIII в течении 30 мин при 16°C.
Оптимальная рабочая температура для Т4 ДНК лигазы + 37°C, но при этой температуре не происходит отжиг липких концов (обычно 2-4 нуклеотида длиной). В тоже время, при оптимальной температуре для отжига (+ 4°C) активность фермента крайне низка. Поэтому обычно выбирают компромиссные условия (14-16°C) для лигирования липких концов. Лигирование тупых концов можно проводить при комнатной температуре. Стандартное время лигирования 10-16 часов, но его можно сократить, используя различные «быстрые» буфера, содержащие в своем составе, как правило, ПЭГ и работающие при комнатной температуре.

Хранение

-20°C.

Транспортировка

+4°C.

Состав буфера

Буфер с АТФ (x10):
300 mM Трис-HCl, pH 7.8 / 25°C, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 10 mM АТФ

Применение

Лигирование двухцепочечной ДНК и линкеров, имеющих как липкие, так и тупые концы.

Особенности

Для улучшения результатов трансформации рекомендуется инактивировать Т4 ДНК лигазу прогреванием при 65°C в течении 10-15 мин.

T4 Полинуклеотидкиназа

Описание

Т4 Полинуклеотидкиназа катализирует перенос гамма-фосфата с АТФ на 5'-ОН группу одно- или двуцепочечных ДНК и РНК, олигонуклеотиды или 3'-монофосфаты (прямая реакция). Эта реакция обратима. В присутствии аденозиндифосфата (АДФ), Т4 Полинуклеотидкиназа проявляет 5'-фосфатазную активность и катализирует обмен фосфатными группами между 5'-Ф-олиго-полинуклеотидами и АТФ (обменная реакция). Фермент также обладает 3'-фосфатазной активностью.

Хранение

-20°C.

Транспортировка

+4°C.

Состав буфера

Буфер с АТФ (x10):
700 mM Трис-HCl, pH 7.6 / 25°C, 100 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 10 mM АТФ

Применение

1. Мечение 5'-концов нуклеиновых кислот с их дальнейшим использованием в качестве:
   • проб для гибридизации
   • проб для картирования транскриптов
   • маркеров для электрофореза
   • праймеров для секвенирования ДНК
   • праймеров для ПЦР
2. 5'-фосфорилирование олигонуклеотидов, продуктов ПЦР, других ДНК или РНК перед лигированием
3. 5'-фосфорилирование праймеров ПЦР
4. удаление 3'-фосфатных групп

Особенности

5'-концы нуклеиновых кислот могут быть помечены как с помощью прямой, так и обменной реакций.
Полиэтиленгликоль (PEG) и спермидин повышают скорость и эффективность реакции фосфорилирования. Полиэтиленгликоль используется в смеси при проведении обменной реакции. Полинуклеотидкиназа Т4 ингибируется ионами аммония, поэтому рекомендуется использовать ацетат натрия для высаживания ДНК перед фосфорилированием.

Т7 РНК полимераза

Описание

T7 РНК полимераза является ДНК-зависимой РНК-полимеразой с высокой специфичностью к промотору бактериофага Т7. Фермент с молекулярным весом 99 кДа обеспечивает in vitro синтез РНК с клонированных последовательностей под контролем Т7 промоторов. Т7 РНК полимераза чрезвычайно чувствительна к ингибированию солями. Общая концентрация соли не должна превышать 50 мМ.

Хранение

-20°C.

Транспортировка

Специальных условий не требуется.

Состав буфера

Буфер с Mg²⁺ (x10):
40 mM Tris-HCl (pH 7.9 @ 25°C), 6 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 2 mM spermidine

Применение

РНК, получаемая с помощью Т7 РНК полимеразы, имеет широкий спектр применения в научных исследованиях и биотехнологии.

Буфер хранения

50mMTris-HCl (pH 7.9 @ 25°C), 100mM NaCl, 20mM β-ME, 1mMEDTA, 50%Glycerol, 0.1%(w/v)Triton®X-100